Как се произвеждат РНК ваксините срещу COVID-19?

Преди да навлезем в материята, да си припомним какво е ваксината на РНК и как действа.

Какво означава РНК ваксина и как действа?

Ваксина по правило е всяка една субстанция, приготвена с цел да създаде имунитет. В случая с РНК ваксините главната съставка е молекула едноверижна РНК. Тази молекула посредством транскрипцията си в нашите клетки произвежда протеини на инфекциозния агент. Новите протеини на инфекциозния агент индуцират имунен отговор със съответно генериране на лимфоцити на паметта.

РНК ваксините не са нови. Водят изучаването си от 90-те години. До ноември 2020 обаче, не е одобрена нито една. Първите РНК ваксини, които получават одобрение (в случая одобрение по спешност) са ваксините срещу COVID-19 на Pfizer/BioNTech и Moderna. Една неотдавнашна статия на New York Times ни разказва как се произвеждат ваксините на информационната РНК на Pfizer.

Стъпка 1. Всичко започва от ДНК

Процесът на производство на ваксините започва от циркулярни молекули ДНК, които съдържат във вътрешността си информация за производството на протеина S, протеин, покриващ коронавируса. Тези циркулярни вериги ДНК, които са изходната материя на ваксината, биват приготвени в лаборатории, с използване на стандартни плазмиди, в които е въведена последователността за протеина S чрез генно инженерство (процес много сходен с молекулярно cut-paste).

Плазмидите могат да се съхраняват при ниска температура в продължение на много време, поради което първата стъпка от цялостния процес е размразяване на флакон от тези, които се използват за съхранението им.

Стъпка 2. ДНК се умножава в бактерии

Следващата стъпка след размразяване на плазмидите, е да се получат много повече от всеки един. За това се прибягва до бактерии, които се размножават бързо и са експерти в умножаването си.

Учените въвеждат плазмидите в бактериите E.coli, широко използвани в лабораториите, и ги култивират през цялата нощ в колби с адекватна за техния растеж среда. Колбите са при адекватна температура (при 37º градуса E. coli растат много добре) и в движение за да се аерира цялата култура и да се оптимизират условията на растеж.

В последствие тази прекултура се добавя към контейнер с до 300 литра среда за култивиране, където се създават условия бактериите да продължават да се размножават в течение на четири дни. Всяка бактерия се нуждае от приблизително 20 минути за да се раздели, поради което крайният резултат е билиони от плазмиди вътре в нея с последователността за протеина S.

Стъпка 3. Пречистване на ДНК

Следващата стъпка от процеса е получаване и пречистване на плазмидите на ДНК, произведени в бактериалната култура. За това се използват стандартни протоколи с различни химични агенти, които разкъсват мембраните на бактериите и позволяват възстановяването на плазмидната ДНК, която е много по-малка от геномната ДНК на бактериите. В последствие ДНК се пречиства за да не останат следи от средата или от бактериите.

Стъпка 4. Анализ на качеството на ДНК

ДНК от плазмидите ще бъде използвано в последващите етапи, поради което е от съществено значение да няма замърсители и последователността от фрагмента, която съдържа информация за протеина S да не е претърпяла мутации по време на амплификацията в бактериите. Ето защо след като веднъж е пречистено ДНК, се осъществяват различни проби за качество за да се потвърди, че плазмидите не са се променили.

ДНК киселините, които преминат качествения контрол могат да бъдат въведени в новите бактерии за да генерират повече плазмиди или да бъдат използвани в следващите стъпки на производство на ваксината.

Стъпка 5. Изрязване и пречистване на ДНК с последователността за протеин S

Следващата стъпка от процеса е изрязването и пречистването на фрагмента от плазмида който съдържа последователността на протеина S. Тази стъпка е необходима, защото ваксините РНК съдържат наследствен материал, съответстващ на S протеина. Тоест голяма част от плазмида не се използва в следващите етапи. По същество ще се използва само ДНК, която кодира S протеина.

За изпълнението на тази стъпка се прибавят ензими, които откъсват ДНК от краищата на интересуващата ни последователност. Тези ензими разпознават специфични последователности от ДНК и срязват циркулярната верига на плазмида така, че се получават линейни молекули на плазмида и на фрагмента, който съдържа протеина S.

Фрагментите ДНК със S протеина се разделят от останалите чрез филтрация така, че крайният резултат от този етап са бутилки от един литър, съдържащи фрагменти от ДНК с информация за протеина S в разтвор. Получената ДНК се анализира отново за потвърждаване на нейното качество за следващите стъпки.

Стъпка 6. От ДНК към РНК

Следващата стъпка е да се използва ДНК, получено като патрон за създаване на информационна РНК.

Разтворът на ДНК се смесва с ензими и компоненти на РНК. Ензимите се заемат да отворят ДНК и да го използват като матрица, за да генерират информационна РНК на протеина S. Този процес отнема няколко часа. Сместа, в която се извършва реакцията, която съдържа ДНК, РНК, ензими и компоненти от РНК, се филтрира в последствие за да се получи единствено информационна РНК.

Стъпка 7. Качествен контрол на РНК

По същия начин, по който се прави с ДНК, учените от Пфайзер изпробват чистотата на разтвора на информационната РНК, резултат от предшестващата стъпка и анализират последователността и, за да потвърдят, че няма модификации или алтерации.

Стъпка 8. Аранжиране на информационната РНК и на липидната обвивка

Ваксините от информационна РНК по същество са молекули РНК, покрити със слой липиди.

Сместа от липиди, които влизат в състава на ваксината се приготвя паралелно с информационната РНК и съдържа четири съставки:

Йонизиращи се липиди с положителен заряд, които да се свържат с информационната РНК, заредена негативно.
Пегилиадни липиди, които допринасят за контролиране на размера и стабилността на вирусните частици и
Неутрални липиди, които допринасят за оформяне на структурата
Холестерол, който помага за формирането на структурата на ваксината.

За смесването на разтвора от информационна РНК с този на липидите в правилна пропорция се използват различни помпи, които контролират потока на компонентите и тяхното взаимодействие. Когато липидите взаимодействат с информационната РНК, заредена отрицателно, се захващат за нея, образувайки два слоя около нея, които я предпазват от околната среда.

В последствие частиците на ваксината се филтрират отново за да се елиминира всякакъв вид замърсяване, например етанола, който се използва за смесване на разтвора от липиди.

В последствие частиците от ваксините се филтрират отново за да се елиминира каквото и да е замърсяване като например етанолът, който се използва за смесването на разтвора от липидите.

Стъпка 9. Приготвяне на ваксините във флаконите

След като веднъж е приготвен разтворът от ваксината, с него се пълнят флаконите, в които ще се разпространява. Всеки флакон съдържа 0,45 милилитра ваксинален разтвор, който след разтваряне ще може да се използва в 6 дози. Тези флакони са предварително измити и стерилизирани и преминават различни проби за качество, които да гарантират, че нямат дефекти, които да компрометират тяхната цялост или ефективността на ваксината, нито пропуски.

Наливането на ваксината във флаконите трябва да се направи бързо, за да се избегне разграждането на информационната РНК. След като веднъж са напълнени, се оценява още веднъж че са интактни. След това се етикетират, поставят се в кутии с капацитет от 195 флакона и се замразяват при -70 градуса по Целзий във фризери, гарантиращи тази температура в целия си интериор.

Стъпка 10. Опаковане и Изпращане

След приготвянето на флаконите с ваксина следващата стъпка е пакетирането им за разпределение в което и да е място по света. В този процес поддържането на студа е от жизненоважно значение, за да гарантира запазването на ефективността на ваксината.

Стековете от 195 флакона се пакетират по пет в кутии със сух лед, които запазват леда достатъчно време докато достигнат адреса си и могат да бъдат складирани или използвани.

Като цяло процесът на производство на ваксина отнема 60 дни.

Не всички стъпки на ваксината се правят в една и съща инсталация. Например в САЩ производството и пречистването на ДНК от плазмидите се провежда в инсталациите на Pfizer в Chesterfield. От там се изпращат бутилки със замразено ДНК в инсталациите на Andover в Massachusetts или Mainz в Германия, където се получава информационна РНК, която на свой ред се изпраща замразена на други инсталации, където се приготвя окончателната ваксина.